UNIDAD DE PROTEÓMICA IPBLN

 
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Cantidad de proteína necesaria para su identificación mediante PMF

        Cuanto mayor sea la cantidad de proteína existente, más fácilmente se podrá llevar a cabo su identificación.

        En el caso de proteínas separadas por SDS-PAGE, 200 femtomoles pueden ser suficientes. Sería recomendable una cantidad mínima de 1-2 picomoles de proteína, ya que sólo una fracción de la misma se recuperará como péptidos para su análisis en el espectrómetro de masas. En consonancia con esto, se puede identificar una proteína que se vea teñida con Azul Coomassie, Sypro Ruby o Plata compatible con masas. Esta última, puede ser más problemática dada su interacción con la muestra.

        En el caso de proteínas en disolución, la cantidad mínima de proteína puede ser de 50-100 fmoles. Su concentración debe ser mayor de 5 fmoles/ml y se especificará esta en la solicitud, así como la composición del disolvente utilizado.

        Las muestras puras siempre proporcionan datos más satisfactorios, por lo que se debe procurar que las bandas, “spots” o disoluciones contengan el menor número posible de proteínas distintas. Hay que tener en cuenta que en la identificación  mediante PMF, debe existir una proteína mayoritaria. Si las muestras tienen varios componentes, estos competirán por los protones en el proceso de ionización y encontraremos señales más altas de los componentes que están a mayor concentración, mientras que los de baja concentración darán señales débiles que pueden ser eliminadas en el procesado del espectro de masas.

 

Cantidad de proteína necesaria para determinar su Masa Molecular

            Suelen ser suficientes cantidades de 1 a 4 picomoles de una proteína para determinar su Masa Molecular mediante MALDI-TOF, preferentemente, a una concentración mínima de 1 pmol/ml.

 

Recomendaciones para la manipulación de muestras y geles

·               Llevar siempre guantes libres de polvo, lavados con agua o etanol antes de ser usados para eliminar posibles contaminaciones con queratinas procedentes de manos, pelo y ropa.

·               Tratar de trabajar tan limpiamente como sea posible, ya que la contaminación con otras proteínas podría impedir la identificación de la proteína de interés. Hay que asegurarse de que tanto el material, como todas las superficies estén extremadamente limpias. Los contaminantes más frecuentes son queratina humana y BSA. La queratina proviene del polvo, pequeños pelos o pelusas y huellas de dedos. Un pequeño pelo contiene cantidades abrumadoras de queratina comparado con la cantidad de proteína de la muestra.

·               Utilizar siempre material limpio, tanto para hacer el gel como para teñirlo.

·               Para la preparación de geles y disoluciones usar agua y reactivos de alta pureza. Los contaminantes de los diferentes reactivos pueden afectar a la identificación de la proteína.

·               Las soluciones de tinción deben ser frescas.

·               Utilizar tubos de propileno siliconizados así como puntas de baja retención de proteínas, para minimizar las pérdidas de proteína por adsorción a las paredes del tubo. No utilizar tubos de vidrio.

·               Si se recortan de forma manual las bandas o manchas, hay que asegurarse que se utilizan superficies extremadamente limpias. Utilizar un bisturí y unas pinzas o una punta desechable convenientemente recortada y no incluir partes del gel no teñidas. Idealmente, esto debería ser hecho en una campana de flujo laminar (tipo cultivo de células) para minimizar la posibilidad de polvo, pelos, escamas de la piel u otras formas de suciedad.

·               Cuando se preparen geles de poliacrilamida, estos deben tener un grosor entre 0.75 y 1 mm con un porcentaje de acrilamida próximo al 12%. La acrilamida libre (no polimerizada) puede reaccionar con los grupos amino de las proteínas durante la electroforesis en el gel. Para evitar esto, comprar los geles hechos para su sistema de electroforesis o bien polimerizar el gel separador 24 h antes de su uso o al menos dejarlo toda la noche polimerizando.

·               Los cristales de electroforesis, peines para geles y cualquier material que se utilice deben limpiarse bien con MetOH o con ácido concentrado.

·               Se recomienda utilizar recipientes que no se dediquen a otros fines que puedan contaminar el gel (p.ej Western-blot: restos de BSA o de leche en polvo pueden llenar el gel de otras proteínas).

·               Conservación del gel: Húmedo en agua o ácido acético al 1% a 4°C hasta el día de su análisis.

 

Solventes para proteínas

        El uso de un apropiado solvente es muy importante para espectrometría de masas. Disolvente volátiles tales como metanol y acetonitrilo son buenos para espectrometría de masas. Evitar el uso de DMSO, DMF y solventes muy polares. Usar siempre solventes grado espectroscopía para preparar las muestras.

        Las sales y tampones repercuten generalmente en detrimento del análisis de masas. Las sales normalmente forman aductos con las proteínas que compiten con el ión molecular de las mismas y ensanchan la señal (especialmente en la determinación de la masa molecular). Se recomiendan concentraciones de sales por debajo de 1mM aunque concentraciones mayores pueden ser toleradas. El acetato amónico usualmente no afecta a la señal por debajo de 20 mM. Sin embargo, sodio y potasio pueden ser un problema por encima de 10mM.
 

Interferentes con el análisis MS

NO INTERFIEREN TFA, ac. fórmico, ClH, ac. acético, β-mercaptoetanol, DTT, NH4OH, solventes orgánicos volátiles.
TOLERABLES < 1M Urea, Guanidina
< 50mM HEPES, MOPS, Tris, Acetato amónico, , ClNa
< 10mM Fosfatos
< 1% (v/v) Glicerol, n-octil-b-glucopiranosido, LDAO (lauryldimethylamine oxide)
< 0.1% (v/v) Azida sódica, PEG 2000, Triton X-100, RTX-100,  NP-40, Tween, Zwittergent
< 0.01% (v/v) SDS, CHAPS
EVITAR DMSO, DMF, NaOAc, KCl

Tabla de equivalencia ng/pmol según PM de la proteína

Para realizar conversiones masa/mol, visite el siguiente enlace: Molbiol.ru

TINCIÓN
Cantidad de proteína(ng)
PM de la proteína (KDa)
12,5
25
50
100
Equivalencia en pmol
COOMASSIE
1000
80
40
20
10
500
40
20
10
5
200
16
8
4
2
100
8
4
2
1

SYPRO RUBY

PLATA

50
4
2
1
0,5
20
1,6
0,8
0,4
0,2
10
0,8
0,4
0,2
0,1
5
0,4
0,2
0,1
0,05
        Para geles teñidos con Coomassie una banda intensa contiene más de 1mg (1000 ng) de proteína y una banda débil discernible, unos 100 ng.

        Para geles teñidos con Plata o Sypro Ruby una banda intensa contiene más de 50 ng y una banda débil unos 5 ng de proteína.