UNIDAD DE PROTEÓMICA IPBLN

 
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P: ¿Que servicios incluye la identificación de proteínas?

   El procedimiento estándar incluye:

·       Recorte automatizado de la banda o mancha (“spot”) de la proteína, y su posterior destinción y lavado  (si se parte de proteínas separadas con geles de SDS-PAGE 2D o 1D).

·        Proceso de reducción y carbamidometilación de las proteínas.

·        Digestión enzimática de las proteínas con tripsina.

·        Análisis de los péptidos mediante espectrometría de masas

tipo MALDI-TOF. Obtención de huella de masas peptídicas.

·        Búsqueda en bases de datos e identificación de la proteína.





P: ¿En cuanto tiempo se obtienen los resultados?

    Los resultados normalmente se remiten al usuario en el plazo de 3-6 días hábiles, desde su recepción en el laboratorio.

    Las muestras se analizarán en riguroso orden de entrada, pero en el caso de saturación puntual, se dará prioridad a 32 muestras por laboratorio.

 



P: ¿Cual es la cobertura típica de una identificación?

    En una identificación de proteínas, la cobertura típica de secuencia es dependiente de la cantidad de proteína presente y también de su naturaleza. Para proteínas abundantes la cobertura puede ser del 70-80 %, mientras que las proteínas poco abundantes o de pequeño tamaño pueden ser identificadas con 2-4 péptidos.

    Debe tenerse en cuenta que las proteínas de bajo peso molecular (<20kDa) pueden resultar difíciles de identificar debido al bajo número de péptidos que genera su digestión enzimática.





P: ¿Qué cantidad de proteína en gel SDS-PAGE se necesita para su identificación?

    Cuanto mayor sea la cantidad de proteína existente, más fácilmente se podrá llevar a cabo su identificación.

    En el caso de proteínas separadas por SDS-PAGE, 200 femtomoles pueden ser suficientes. Sería recomendable una cantidad mínima de 1 - 2 picomoles de proteína, ya que sólo una fracción de la misma se recuperará como péptidos para su análisis en el espectrómetro de masas. En consonancia con esto, se puede identificar una proteína que se vea teñida con Azul Coomassie, Sypro Ruby o Plata compatible con masas. Esta última, puede ser más problemática dada su interacción con la muestra. (TABLA DE EQUIVALENCIAS).





P: ¿Qué cantidad de proteína en disolución se necesita para su identificación?

    Cuanto mayor sea la cantidad de proteína existente, más fácilmente se podrá llevar a cabo su identificación. Se requiere que la proteína a identificar haya sido purificada o, al menos, sea mayoritaria.

    En el caso de proteínas en disolución, la cantidad mínima de proteína puede ser de 50-100 fmoles (TABLA DE EQUIVALENCIAS).Su concentración debe ser mayor de 5 fmol/ml y se especificará en la solicitud, así como la composición del disolvente utilizado.


 


P: ¿Qué cantidad de proteína en disolución se necesita para determinar su masa molecular?

     Suelen ser suficientes cantidades de 1 a 4 picomoles de una proteína para determinar su Masa Molecular mediante MALDI-TOF, preferentemente, a una concentración mínima de 1 pmol/ml.

 



P: ¿Puedo identificar por espectrometría de masas una proteína procedente de una banda detectable en western?  

    No siempre siempre se puede identificar por espectrometría de masas, una proteína detectada por “Western Blot”, debido a que los anticuerpos utilizados en esta técnica, pueden ser increiblemente sensibles. Con un buen anticuerpo monoclonal se puede detectar del orden de unos pocos picogramos de proteína. Muchas veces, estos niveles están por debajo de aquellos necesarios en espectrometría de masas. Si la cantidad de proteína está por debajo del nanogramo, entonces la identificación no será posible.